溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基之间以及壳糊精中N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基之间的β（1→4）连接。 革兰氏阳性细胞对这种水解非常敏感，因为它们的细胞壁中的肽聚糖比例很高。革兰氏阴性菌就对这种水解没那么敏感，因为它们有外膜并且肽聚糖的比例较低。然而，这些细胞可能在细胞外膜中螯合金属离子的EDTA存在的情况下水解。

该酶在广泛的pH范围（6.0至9.0）内具有活性。pH值为6.2时，可在更广的离子强度范围（0.02至0.100 M）观察到活性，而pH值为9.2时为0.01至0.06 M。